Описание
Набор реагентов «RealQuant H3» предназначен для обнаружения и определения количества ДНК человека, степени ее деградации, половой принадлежности и наличия ингибиторов в образце ДНК. Все это является важными показателями для оценки качества ДНК в криминалистических образцах перед проведением STR-анализа. Набор реагентов предназначен для использования на амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
В основе работы набора лежит метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием TaqMan зондов. Для повышения чувствительности детекции в наборе «RealQuant H3» используются многокопийные локусы генома человека. Амплификация многокопийных аутосомных фрагментов разного размера и многокопийного фрагмента Y-хромосомы позволяет провести достоверную оценку количества и качества ДНК в исследуемом образце.
Спецификация
| № | Мишень | Описание фрагмента | Краситель |
|---|---|---|---|
| 1 | Y | ДНК Y-хромосомы | FAM |
| 2 | Small autosomal | аутосомная ДНК, короткий фрагмент | VIC |
| 3 | Large autosomal | аутосомная ДНК, длинный фрагмент | TAMRA |
| 4 | IPC | внутренний положительный контроль | ROX |
Пассивный референсный краситель – MP.
Короткий фрагмент аутосомной ДНК (Small autosomal) используется для определения концентрации общей ДНК в исследуемом образце.
Длинный фрагмент аутосомной ДНК (Large autosomal) необходим для определения степени деградации ДНК в исследуемом образце. По соотношению полученных в ходе ПЦР значений концентраций короткого и длинного аутосомного фрагмента можно судить о деградации ДНК в образце, и спрогнозировать необходимое количество ДНК, которое нужно внести в STR-реакцию для получения полного профиля.
Фрагмент Y-хромосомы (Y) позволяет определить половую принадлежность образца ДНК уже перед проведением STR-анализа. И при возникновении сложностей с интерпретацией данных STR-анализа, может служить дополнительным половым маркером. Так же фрагмент Y-хромосомы может использоваться для оценки смесевых образцов мужской и женской геномной ДНК.
Внутренний положительный контроль (IPC) – это независимая реакция амплификации компоненты которой содержатся в реакционной смеси набора. IPC подтверждает, что все компоненты набора функционируют правильно. Так же IPC помогает оценить наличие или отсутствие ингибиторов в образце ДНК и принять решение о возможности использования образца ДНК в STR-реакции.
Калибровочная кривая набора строится по пяти точкам с десятикратным разведением от первой точки с концентрацией 50 нг/мкл, что позволяет установить диапазон достоверной оценки концентрации ДНК в образце от 50 до 0,005 нг/мкл.
Параметры калибровочных кривых для прибора 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems): коэффициент корреляции R2 >0.99, наклон калибровочной кривой – от -3,2 до -3,7
Для внесения в реакционную смесь достаточно 2 мкл образца ДНК, что снижает потери особо значимых образцов.
Набор реагентов «RealQuant H3» прошел испытания на специфичность к ДНК, наиболее часто встречающихся в обиходе человека животных.
Животные, к ДНК которых проводились испытания на специфичность набора «RealQuant H3»
| Образец | Млекопитающие | макака |
| кошка | ||
| собака | ||
| хомяк | ||
| хорёк | ||
| мышь | ||
| кролик | ||
| коза | ||
| овца | ||
| свинья | ||
| корова | ||
| лошадь | ||
| Птицы | курица | |
| гусь | ||
| Рыбы | карп |
В результате проведенных исследований выявлена высокая специфичность к ДНК человека и отсутствие таковой к ДНК животных, использованной в испытаниях.
Набор может быть использован в лабораториях бюро судебно-медицинских экспертиз и в лабораториях экспертно-криминалистических центров. Результаты, полученные с использованием набора «RealQuant H3» могут помочь в:
- определении наличия ДНК человека в образце;
- определении концентрации общей геномной ДНК человека в образце;
- оценке деградации ДНК в образце;
- определении половой принадлежности ДНК в образце;
- оценке наличия ингибиторов в образце ДНК;
- определении количества образца ДНК для использования в STR анализе с учетом деградации и наличия ингибиторов.