Компания Биохид поставляет все необходимое для проведения полимеразной цепной реакции. В нашем каталоге представлено лабораторное оборудование для качественных и количественных генетических исследований в разнообразных сферах.
Представляет собой молекулярное исследование биологического материала на специальном оборудовании, в ходе которого можно точно выявить в образце следы патогенов в виде их ДНК или РНК. Этот диагностический метод является быстрым и высокоточным благодаря особой чувствительности реагентов и специфичности выявляемых веществ. Он часто используется для выявления различных заболеваний, а также исследований в других областях.
Принцип метода ПЦР
Принцип метода основан на многократном умножении конкретного участки цепочки ДНК в искусственно созданных условиях под действием специальных ферментов. В ходе репликации определенной части генетического материала накапливается достаточное его количество, позволяющее зафиксировать положительный результат. В процессе происходит копирование только одного соответствующего заданным в начале условиям участка ДНК – только в том случае, если он содержится в пробе. Именно поэтому этот метод позволяет достаточно легко определить различные специфические заболеваний или генетические нарушения при довольно низком проценте ложноотрицательных результатов исследований.
В ходе процесса отобранный для исследования биологический материал помещается в особые условия. В этих условиях образец ДНК или РНК в пробе – предположительно находящийся в ней и подлежащий детекции – начинает многократно удваиваться. В двухцепочечном образце дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или однонитевом участке рибонуклеиновой кислоты (РНК) содержится вся необходимая информация о предположительном патогене или ошибке в геноме. При нахождении в пробе небольшого количества искомых частиц через несколько часов их количество увеличится в геометрической прогрессии и достигнет многомиллионного содержания единиц. Такое количество будет обнаружено высокочувствительными реагентами, что даст положительный результат исследования.
Виды ПЦР
Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году. С тех пор ученые-исследователи продолжают усовершенствование этого метода с помощью оборудования, адаптируя его биохимический механизм под задачи из разных областей. В лабораторных условиях используются такие основные методы как стандартная качественная реакция в режиме реального времени, а также обратная транскрипция.
«Классическая» реакция позволяет ответить на вопрос о наличии либо отсутствии в исследуемом образце определенного генетического материала. При этом данное исследование не дает информации о количестве подтвержденного патогена. Этот метод используется для подтверждения заражения или установления идентичности одного образца другому.
Полимеразная реакция в режиме реального времени – не только качественный, но также количественный метод исследования. Он позволяет обнаружить наличие патогенного ДНК-образца в пробе, а также точно подсчитать количество его копий. С помощью этого метода и специализированного оборудования в реальном времени можно установить тяжесть обнаруженной инфекции на основе количественного результата, а также рассчитать дозировку необходимых лекарственных препаратов и срок их приема, анализируя те же данные.
Реакция с обратной транскрипцией используется для исследований образцов с предполагаемым содержанием патогенной РНК. Этот метод актуален для выявления некоторых заболеваний, возбудители которых не имеют своей ДНК. В случае, когда генетический материал патогена представлен одной нитью нуклеотидов (РНК), а не ДНК-молекулой из двух цепочек, «стандартная» цепная реакция не сработает.
При обратной транскрипции у молекулы РНК принудительно «достраивается» вторая нить нуклеотидов с помощью специального фермента. Это вещество называется обратная транскриптаза, что и дало название методу. РНК-молекула трансформируется в ДНК, которая уже готова подвергаться копированию в ходе «обычной” ПЦР.
Оборудование и расходные материалы для ПЦР
Для выполнения ПЦР в лабораторных условиях нужно соответствующее оборудование и реагенты. Специальный прибор – амплификатор – позволяет создать нужные условия для проведения исследования. Внутри амплификатора поддерживается заданный уровень температуры и происходит цикличное удвоение искомого ДНК. Этот процесс называется амплификация. При накоплении достаточного количества молекул для фиксации качественного или количественного результата, прибор проведет анализ обработанной пробы и отобразит данные.
Кроме непосредственно амплификатора для реакции нужны и другие расходные материалы:
- Целевая ДНК или ДНК-матрица. Она представляет собой частицу генетического материала предполагаемого патогена и имеет уникальное строение в виде цепочки нуклеотидов. При таком исследовании вирусных инфекций, например, целью для обнаружения является уникальная часть вируса, по которой его можно отличить от других;
- Праймеры. Для выполнения метода нужны два праймера – биологические вещества в виде коротких нитей нуклеотидов. Они подходят к ДНК предполагаемого патогена аналогично кусочкам мозаики – в этом случае реакция будет положительной. Праймеры служат основой для удвоения искомого ДНК в пробе, поэтому при его отсутствии реакция будет отрицательной;
- Специальный фермент – ДНК-полимераза. Она нужна для «строительства» нити ДНК в процессе исследования; Нуклеотидная смесь – дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Эти вещества нужны для стабильного копирования искомого ДНК патогена, выступая в качестве строительного материала;
- Ионы магния. Положительно заряженные ионы магния необходимы для стабильной активности ДНК-полимеразы в ходе амплификации;
- Буферный раствор. Эта смесь нужна для создания оптимальных условий для биохимической реакции внутри амплификатора.
В каталоге Биохид есть надежные амплификаторы от известных брендов, а также качественные расходные материалы для точного протекания всех процессов обработки и удвоения генетического материла.
Этапы ПЦР
Выявление проходит поэтапно:
- Денатурация. В начале исследования образец нагревают, в результате чего весь генетический материал в пробе распадается на две нити РНК. Для образцов с содержанием РНК сначала выполняется реакцию с обратной транскрипцией. Для трансформации генетического материала специфического патогена в ДНК;
- Отжиг. На этом этапе происходит снижение температуры, а праймеры присоединяются к концам целевой ДНК при ее наличии в пробе;
- Элонгация. По окончании фазы отжига активизируется ДНК-полимераза для достраивания второй нити ДНК от участка с присоединенным праймером с помощью дНТФ.
В ходе метода происходит несколько десятков циклов амплификации с удвоением генетического материала: 2 цепочки превращаются в 4, 4 – в 8 и так далее.
Применение ПЦР для диагностики заболеваний
Каждый возбудитель инфекционных заболеваний имеет уникальный генетический материал, зашифрованный в их молекулах РНК или ДНК. Метод позволяет точно идентифицировать в биологическом материале вирусы, бактерии или грибки. Этот метод широко применяется в медицине для точного выявления различных заболеваний. Исследование позволяет быстро идентифицировать болезнетворные микроорганизмы и вовремя начать лечение.
Для точного исследования необходимо выбрать конкретный патоген, наличие или отсутствие которого нужно определить в пробе. По этой причине этот метод для выявления заболевания назначает врач, основываясь на специфических жалобах пациента, результатах осмотра и других обследований.
Вирусы и бактерии имеют уникальные ДНК или РНК, по следам которых в исследуемой пробе можно установить инфицирование. Реакция в реальном времени также позволяет подсчитать количество патогена после амплификации. На основании результата лечащий врач поставит точный диагноз, подберет курс лечения и дозировку препаратов.
Условно-патогенные микроорганизмы в отличие от вирусов не всегда приносят вред организму. При увеличении их числа наступает особое состояние – дисбактериоз, которое становится причиной поражений кожи и ЖКТ, а также гинекологических заболеваний. Качественное исследование в режиме реального времени позволяют установить отклонение от нормы и принять меры для восстановления нормальной микрофлоры.
Для выявления грибковых инфекций в основном используется микроскопическое исследование, но этот метод помогает прицельно выявить специфического возбудителя среди нормального микробиома кожи и слизистых, а также установить степень поражения возбудителем.
Другие сферы применения
Уникальный генетический код есть у всех живых существ, поэтому этот метод применяется везде, где может потребоваться идентификация по уникальному биологическому «следу»:
Установление родства
Установление родства на основании биологических образцов иногда требует увеличения количества генетического материала из-за его нехватки для проведения исследований. Амплификация ДНК позволяет получить точный результат как для живых организмов, так и посмертно;
Диагностика наследственных генетических заболеваний
Полимеразная цепная реакция помогает обнаружить специфические гены в ДНК человека, отвечающие за развитие определенных болезней или предрасположенность к некоторым состояниям вроде лишнего веса. Исследования назначаются врачом для составления плана профилактики патологических состояний или планирования семьи;
Диагностика генетических мутаций
Метод позволяет идентифицировать мутации в геноме, которые влияют на эффективность применения лекарственных препаратов. Некоторые гены следует учитывать при составлении плана лечения, например, при заболевании бронхиальной астмой или в случае хронической сердечной недостаточности у пациента;
Судмедэкспертиза и криминалистика
Диагностика также используется для расследования противоправной деятельности, когда нужно точно установить причастность к преступлению. ДНК разных людей практически идентична – уникально всего 0,1%. На основании этой части генетического кода можно идентифицировать личность как жертвы преступления, так и преступника. Метод позволяет умножить малую часть генетического материала в случаях, когда его не хватает для опознания – например, при разложении тела или его обугливании.
Кроме этого он также помогает установить вину подозреваемого на основании следов ДНК. При обнаружении на месте преступления любого генетического материала – волос, частиц кожи или различных биологических жидкостей – можно провести исследование для идентификации личности преступника.
Ветеринария
Используется для всех живых организмов – как людей, так и животных Ветеринары используют его для постановки диагноза, назначения лечения и анализа его эффективности. обследование диких животных позволяет выявить опасные для жизни человека инфекции (бешенство, чума) и предупредить развитие эпидемии.
Растениеводство
ПЦР может быть эффективна для диагностики болезней растений. Фитопатологии могут привести к полной гибели урожая, но ПЦР позволяет вовремя принять меры для защиты растений или их лечения;
Контроль продуктов питания
В пищевой индустрии сегодня широко применяются генно-модифицированные организмы. Исследование позволяют контролировать количество ГМО в продуктах и кормах, а также анализировать их качество. Генно-модифицированные организмы создаются в лабораторных условиях путем редактирования генома. Метод же позволяет сохранить и преумножить удачные образцы для дальнейшего использования, усовершенствования, разработки новых продуктов.
Преимущества ПЦР
ПЦР является одним из самых точных и эффективных методов выявления следов генетического материала в биологическом образце. Это исследование дает надежный результат даже при низкой концентрации искомого вещества в пробе.
Высокая точность результатов обусловлена специфичностью и чувствительностью метода:
- Низкая вероятность ложноотрицательного результата обеспечивает высокую чувствительность исследования. При этом исследовании этот параметр составляет 90-100%. По сравнению с ПЦР чувствительность ИФА составляет 50-70%, микробиологического посева – 60-80%;
- Низкая вероятность ложноположительного результата обеспечивает высокую специфичность реакции. ПЦР имеет стопроцентную специфичность – при отсутствии в пробе искомого генетического материала реакция отсутствует.
- Скорость – еще одно преимущество метода. Обычно результат готов уже через один день. По сравнению с ПЦР метод посева биологического материала требует в среднем нескольких суток, как и выполнение иммуноферментного анализа.
На ход обследования не влияют неспецифические особенности исследуемых патогенов. Так, для посева биоматериала требуется культивирование микроорганизмов в специфических условиях питательной среды. Для некоторых возбудителей заболеваний микробиологическое культивирование в лабораторных условиях невозможно. ПЦР требует только соблюдения стерильности оборудования и правильной подготовки исследуемой пробы.
Прицельность ПЦР можно отнести и к ее минусам, так как исследование всегда имеет только одну специфическую цель. В ходе реакции можно обнаружить только конкретного возбудителя, чей генетический материал будет копироваться в амплификаторе. При смешанных инфекциях ПЦР выявит только один патоген – на который ориентировано исследование. Этот метод исключает одновременное обнаружение в пробе нескольких возбудителей разных заболеваний.
Биохид поставляет высококачественное оборудование для апмлификации ДНК и РНК с доставкой. Наши менеджеры проконсультируют по ассортименту диагностических средств и помогут оформить заказ оборудования для ПЦР.