Компания Биохид поставляет оборудование для проведения полимеразной цепной реакции, молекулярных исследований биологического материала в лабораториях.
Оборудование для ПЦР точно выявляет в образце следы патогенов в виде их ДНК или РНК. Этот диагностический метод быстр и высокоточен из-за чувствительности реагентов и специфичности выявляемых веществ.
Принцип метода ПЦР
Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году. Ученые-исследователи продолжают усовершенствование этого метода с помощью оборудования, адаптируя его биохимический механизм под задачи из разных областей. В лабораториях используются такие основные методы как проведение стандартной реакции в режиме реального времени, а также обратная транскрипция.
В ходе процесса отобранный для исследования биологический материал помещается в особые условия. В этих условиях образец ДНК или РНК в пробе – предположительно находящийся в ней и подлежащий детекции – начинает многократно удваиваться. В двухцепочечном образце дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или однонитевом участке рибонуклеиновой кислоты (РНК) содержится вся необходимая информация о предположительном патогене или ошибке в геноме. При нахождении в пробе небольшого количества искомых частиц через несколько часов их количество увеличится в геометрической прогрессии и достигнет многомиллионного содержания единиц. Такое количество будет обнаружено высокочувствительными реагентами, что даст положительный результат исследования.
Виды ПЦР
Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году. Ученые-исследователи продолжают усовершенствование этого метода, адаптируя его биохимический механизм под задачи из разных областей. В лабораторных условиях используются такие основные методы как стандартная качественная реакция в режиме реального времени, а также обратная транскрипция.
«Классическая» реакция позволяет ответить на вопрос о наличии либо отсутствии в исследуемом образце определенного генетического материала. При этом данное исследование не дает информации о количестве подтвержденного патогена. Этот метод используется для подтверждения заражения или установления идентичности одного образца другому.
Полимеразная реакция в режиме реального времени – не только качественный, но также количественный метод исследования. Он позволяет обнаружить наличие патогенного ДНК-образца в пробе, а также точно подсчитать количество его копий. С помощью этого метода в реальном времени можно установить тяжесть обнаруженной инфекции на основе количественного результата, а также рассчитать дозировку необходимых лекарственных препаратов и срок их приема, анализируя те же данные.
Реакция с обратной транскрипцией используется для исследований образцов с предполагаемым содержанием патогенной РНК. Этот метод актуален для выявления некоторых заболеваний, возбудители которых не имеют своей ДНК. В случае, когда генетический материал патогена представлен одной нитью нуклеотидов (РНК), а не ДНК-молекулой из двух цепочек, «стандартная» цепная реакция не сработает.
При обратной транскрипции у молекулы РНК принудительно «достраивается» вторая нить нуклеотидов с помощью специального фермента. Это вещество называется обратная транскриптаза, что и дало название методу. РНК-молекула трансформируется в ДНК, которая уже готова подвергаться копированию в ходе «обычной” ПЦР.
Оборудование и расходные материалы для ПЦР
Для выполнения ПЦР в лабораторных условиях нужно соответствующее оборудование и реагенты. Специальный прибор – амплификатор – позволяет создать нужные условия для проведения исследования. Внутри амплификатора поддерживается заданный уровень температуры и происходит цикличное удвоение искомого ДНК. Этот процесс называется амплификация. При накоплении достаточного количества молекул для фиксации качественного или количественного результата, прибор проведет анализ обработанной пробы и отобразит данные.
Кроме непосредственно амплификатора для реакции нужны и другие расходные материалы:
- Целевая ДНК или ДНК-матрица. Она представляет собой частицу генетического материала предполагаемого патогена и имеет уникальное строение в виде цепочки нуклеотидов. При таком исследовании вирусных инфекций, например, целью для обнаружения является уникальная часть вируса, по которой его можно отличить от других;
- Праймеры. Для выполнения метода нужны два праймера – биологические вещества в виде коротких нитей нуклеотидов. Они подходят к ДНК предполагаемого патогена аналогично кусочкам мозаики – в этом случае реакция будет положительной. Праймеры служат основой для удвоения искомого ДНК в пробе, поэтому при его отсутствии реакция будет отрицательной;
- Специальный фермент – ДНК-полимераза. Она нужна для «строительства» нити ДНК в процессе исследования; Нуклеотидная смесь – дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Эти вещества нужны для стабильного копирования искомого ДНК патогена, выступая в качестве строительного материала;
- Ионы магния. Положительно заряженные ионы магния необходимы для стабильной активности ДНК-полимеразы в ходе амплификации;
- Буферный раствор. Эта смесь нужна для создания оптимальных условий для биохимической реакции внутри амплификатора.
В каталоге Биохид есть надежное оборудование для ПЦР от известных брендов, а также качественные расходные материалы. Мы поможет вам подобрать и купить необходимое оборудование для лаборатории.
Этапы ПЦР
Выявление проходит поэтапно:
- Денатурация. В начале исследования образец нагревают, в результате чего весь генетический материал в пробе распадается на две нити РНК. Для образцов с содержанием РНК сначала выполняется реакцию с обратной транскрипцией. Для трансформации генетического материала специфического патогена в ДНК;
- Отжиг. На этом этапе происходит снижение температуры, а праймеры присоединяются к концам целевой ДНК при ее наличии в пробе;
- Элонгация. По окончании фазы отжига активизируется ДНК-полимераза для достраивания второй нити ДНК от участка с присоединенным праймером с помощью дНТФ.
В ходе метода происходит несколько десятков циклов амплификации с удвоением генетического материала: 2 цепочки превращаются в 4, 4 – в 8 и так далее.
Применение ПЦР для диагностики заболеваний
Каждый возбудитель инфекционных заболеваний имеет уникальный генетический материал, зашифрованный в их молекулах РНК или ДНК. Метод позволяет точно идентифицировать в биологическом материале вирусы, бактерии или грибки и вовремя начать лечение.
Для точного исследования необходимо выбрать конкретный патоген, которого нужно определить в пробе. Метод для выявления заболевания назначает врач, основываясь на жалобах пациента, результатах осмотра и других обследований.
Вирусы и бактерии имеют уникальные ДНК или РНК, по следам которых в исследуемой пробе можно установить инфицирование. Реакция в реальном времени также позволяет подсчитать количество патогена после амплификации. На основании результата лечащий врач поставит точный диагноз, подберет курс лечения и дозировку препаратов.
Условно-патогенные микроорганизмы в отличие от вирусов не всегда приносят вред организму. При увеличении их числа наступает особое состояние – дисбактериоз, которое становится причиной поражений кожи и ЖКТ, а также гинекологических заболеваний. Исследование в режиме реального времени устанавливает отклонение от нормы и принять меры для восстановления нормальной микрофлоры.
Для выявления грибковых инфекций в основном используется микроскопическое исследование. Используя этот метод, оборудование для ПЦР помогает прицельно выявить возбудителя среди нормального микробиома кожи и слизистых, а также установить степень поражения возбудителем.
Другие сферы применения
Уникальный генетический код есть у всех живых существ, поэтому этот метод применяется везде, где может потребоваться идентификация по уникальному биологическому «следу»:
Установление родства
Установление родства на основании биологических образцов иногда требует увеличения количества генетического материала из-за его нехватки для проведения исследований. Амплификация ДНК позволяет получить точный результат как для живых организмов, так и посмертно;
Наследственные генетические заболевания
Полимеразная цепная реакция помогает обнаружить специфические гены в ДНК человека, отвечающие за развитие определенных болезней или предрасположенность к некоторым состояниям вроде лишнего веса. Исследования назначаются врачом для составления плана профилактики патологических состояний или планирования семьи;
Генетические мутации
Метод позволяет идентификаций мутаций в геноме, которые влияют на эффективность применения лекарственных препаратов. Некоторые гены следует учитывать при составлении плана лечения, например, при заболевании бронхиальной астмой или в случае хронической сердечной недостаточности у пациента.
Судмедэкспертиза и криминалистика
Диагностика также используется для расследования противоправной деятельности, когда нужно точно установить причастность к преступлению. ДНК разных людей практически идентична – уникально всего 0,1%. На основании этой части генетического кода можно идентифицировать личность как жертвы преступления, так и преступника. Метод позволяет умножить малую часть генетического материала в случаях, когда его не хватает для опознания – например, при разложении тела или его обугливании.
Кроме этого он также помогает установить вину подозреваемого на основании следов ДНК. При обнаружении на месте преступления любого генетического материала – волос, частиц кожи или различных биологических жидкостей – можно провести исследование для идентификации личности преступника.
Ветеринария
Используется для всех живых организмов: людей, животных. Ветеринары используют его для постановки диагноза, назначения лечения. Обследование диких животных выявляет опасные для жизни человека инфекции. Предупреждает развитие эпидемии.
Растениеводство
ПЦР может быть эффективна для диагностики болезней растений. Фитопатологии могут привести к полной гибели урожая, но ПЦР позволяет вовремя принять меры для защиты растений или их лечения;
Контроль продуктов питания
В пищевой индустрии широко применяются генно-модифицированные организмы. Исследование позволяют контролировать количество ГМО в продуктах и кормах, а также анализировать их качество. Генно-модифицированные организмы создаются в лабораторных условиях путем редактирования генома. Метод сохраняет и преумножает удачные образцы для дальнейшего использования, усовершенствования, разработки новых продуктов.
Преимущества ПЦР
ПЦР один из самых точных и эффективных методов выявления следов генетического материала в биологическом образце. Это исследование дает надежный результат даже при низкой концентрации искомого вещества в пробе.
Высокая точность результатов обусловлена специфичностью и чувствительностью метода:
- Низкая вероятность ложноотрицательного результата обеспечивает высокую чувствительность исследования. При этом исследовании этот параметр составляет 90-100%. По сравнению с ПЦР чувствительность ИФА составляет 50-70%, микробиологического посева – 60-80%;
- Низкая вероятность ложноположительного результата обеспечивает высокую специфичность реакции. ПЦР имеет стопроцентную специфичность – при отсутствии в пробе искомого генетического материала реакция отсутствует.
- Скорость – еще одно преимущество метода. Обычно результат готов уже через один день. По сравнению с ПЦР метод посева биологического материала требует в среднем нескольких суток, как и выполнение иммуноферментного анализа.
На ход обследования не влияют неспецифические особенности исследуемых патогенов. Так, для посева биоматериала требуется культивирование микроорганизмов в специфических условиях питательной среды. Для некоторых возбудителей заболеваний микробиологическое культивирование в лабораторных условиях невозможно. ПЦР требует только соблюдения стерильности приборов и правильной подготовки исследуемой пробы.
Прицельность ПЦР можно отнести и к ее минусам, так как исследование всегда имеет только одну специфическую цель. В ходе реакции можно обнаружить только конкретного возбудителя, чей генетический материал будет копироваться в амплификаторе. При смешанных инфекциях ПЦР выявит только один патоген – на который ориентировано исследование. Этот метод исключает одновременное обнаружение в пробе нескольких возбудителей разных заболеваний.
Биохид поставляет качественное оборудование для апмлификации ДНК и РНК с доставкой. Наши менеджеры проконсультируют по ассортименту диагностических средств и помогут оформить заказ на приборы ПЦР.